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  • 天成用户

    提交于 2018-02-15 22:02:03

    操作步骤(仅供参考):
    1、 配制JC-1染色工作液:
    取适量JC-1 Stain (200×),按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀释JC-1,剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2ml JC-1 Buffer(5×),混匀后即为JC-1染色工作液。6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1ml,其它培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推。
    2、 设置阳性对照:
    推荐CCCP(10mM)加入到细胞培养液中处理细胞。随后按照下述方法装载JC-1,进行线粒体膜电位的检测。对于特定的细胞,CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同,需自行参考相关文献资料确定。
    3、对于悬浮细胞:
    a. 取1~6×105细胞,重悬于0.5ml细胞培养液中,细胞培养液中可以含血清和酚红。
    b. 加入0.5ml JC-1染色工作液,颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育。
    c. 在孵育期间,按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入4ml蒸馏水的比例,配制适量的JC-1 Buffer(1×),并放置于冰浴。
    d. 37℃孵育结束后, 4℃ 600g离心3~4min,沉淀细胞。弃上清,注意尽量不要吸除细胞。
    f. 再用JC-1 Buffer(1×)重悬后,用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察,也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
    4、对于贴壁细胞:
    注意:对于贴壁细胞,如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测,应先收集细胞,重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
    a.吸除6孔板培养液,根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次,加入1ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
    b. 加入1ml JC-1染色工作液,充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育。
    c. 在孵育期间,按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸馏水的比例,配制适量的JC-1 Buffer(1×),并放置于冰浴。
    d. 37℃孵育结束后, 吸除上清,用JC-1 Buffer(1×)洗涤2次。
    e. 加入2ml细胞培养液,培养液中可以含有血清和酚红。
    f. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
    5、对于纯化的线粒体:
    a. 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀释5倍。
    b. 0.9ml 5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10~100μg纯化的线粒体。
    c. 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测:混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描,激发波长为485nm,发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪,激发波长不能设置为485nm时,可以在475~520nm范围内设置激发波长。另外,也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。
    d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察:方法同下面的步骤6。
    6、荧光观测和结果分析:
    检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm,发射光设置为530nm;检测JC-1聚合物时,可以把激发光设置为525nm,发射光设置为590nm。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常,细胞的状态也比较正常。

    注意事项:
    1、 JC-1 Stain(200×)应完全溶解混匀后使用,但应避免反复冻融。必须先把JC-1 Stain(200×)用ddH2O充分溶解混匀后,才可加入JC-1 Buffer(1×)。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×),否则导致JC-1很难充分溶解,严重影响后续的检测。
    2、 对于6孔板中的样品,本试剂盒共可以检测100个样品;对于12孔中的样品,本试剂盒共可以检测200个样品。
    3、 装载完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗涤时,尽量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右,此时的洗涤效果较好。
    4、 勿把JC-1 Buffer(5×)全部配制成1×,因为操作过程中需直接使用JC-1 Buffer(5×)。
    5、 如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀,必须全部溶解后才能使用,为促进溶解可以在37℃加热。
    6、 CCCP为线粒体电子传递链抑制剂,有一定毒性,请注意小心防护。

全部回答(1)
  • 本回答由提问者推荐

    2018-02-15 22:02:03 提交于 2018-02-15 22:02:03

    操作步骤(仅供参考):
    1、 配制JC-1染色工作液:
    取适量JC-1 Stain (200×),按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀释JC-1,剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2ml JC-1 Buffer(5×),混匀后即为JC-1染色工作液。6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1ml,其它培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推。
    2、 设置阳性对照:
    推荐CCCP(10mM)加入到细胞培养液中处理细胞。随后按照下述方法装载JC-1,进行线粒体膜电位的检测。对于特定的细胞,CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同,需自行参考相关文献资料确定。
    3、对于悬浮细胞:
    a. 取1~6×105细胞,重悬于0.5ml细胞培养液中,细胞培养液中可以含血清和酚红。
    b. 加入0.5ml JC-1染色工作液,颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育。
    c. 在孵育期间,按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入4ml蒸馏水的比例,配制适量的JC-1 Buffer(1×),并放置于冰浴。
    d. 37℃孵育结束后, 4℃ 600g离心3~4min,沉淀细胞。弃上清,注意尽量不要吸除细胞。
    f. 再用JC-1 Buffer(1×)重悬后,用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察,也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
    4、对于贴壁细胞:
    注意:对于贴壁细胞,如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测,应先收集细胞,重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
    a.吸除6孔板培养液,根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次,加入1ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
    b. 加入1ml JC-1染色工作液,充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育。
    c. 在孵育期间,按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸馏水的比例,配制适量的JC-1 Buffer(1×),并放置于冰浴。
    d. 37℃孵育结束后, 吸除上清,用JC-1 Buffer(1×)洗涤2次。
    e. 加入2ml细胞培养液,培养液中可以含有血清和酚红。
    f. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
    5、对于纯化的线粒体:
    a. 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀释5倍。
    b. 0.9ml 5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10~100μg纯化的线粒体。
    c. 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测:混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描,激发波长为485nm,发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪,激发波长不能设置为485nm时,可以在475~520nm范围内设置激发波长。另外,也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。
    d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察:方法同下面的步骤6。
    6、荧光观测和结果分析:
    检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm,发射光设置为530nm;检测JC-1聚合物时,可以把激发光设置为525nm,发射光设置为590nm。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常,细胞的状态也比较正常。

    注意事项:
    1、 JC-1 Stain(200×)应完全溶解混匀后使用,但应避免反复冻融。必须先把JC-1 Stain(200×)用ddH2O充分溶解混匀后,才可加入JC-1 Buffer(1×)。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×),否则导致JC-1很难充分溶解,严重影响后续的检测。
    2、 对于6孔板中的样品,本试剂盒共可以检测100个样品;对于12孔中的样品,本试剂盒共可以检测200个样品。
    3、 装载完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗涤时,尽量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右,此时的洗涤效果较好。
    4、 勿把JC-1 Buffer(5×)全部配制成1×,因为操作过程中需直接使用JC-1 Buffer(5×)。
    5、 如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀,必须全部溶解后才能使用,为促进溶解可以在37℃加热。
    6、 CCCP为线粒体电子传递链抑制剂,有一定毒性,请注意小心防护。