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  • 天成用户

    提交于 2018-01-27 04:01:33

    一个qpcr反应中是不是只需要一个探针引物就可以了
    一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引 物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中,有下面几点需要注意:

    1. MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。

    2. 更多的配制Mix进行,减少加样误差。最好能在冰上操作。

    3. 每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样!

    4. 所有成分加完后,离心去除气泡。

    5. 每个样品至少3个平行孔。

全部回答(1)
  • 本回答由提问者推荐

    2018-01-27 04:01:33 提交于 2018-01-27 04:01:33

    一个qpcr反应中是不是只需要一个探针引物就可以了
    一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引 物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中,有下面几点需要注意:

    1. MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。

    2. 更多的配制Mix进行,减少加样误差。最好能在冰上操作。

    3. 每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样!

    4. 所有成分加完后,离心去除气泡。

    5. 每个样品至少3个平行孔。