• 实名认证icon

    实名认证

  • 担保交易icon

    担保交易

  • 全额退款icon

    全额退款

您的位置:首页 > 问题中心 > 我要回答
  • 天成用户

    提交于 2018-01-28 06:01:09

    (转载,仅供参考)
    a)针对双标记探针的引物和探针设计的规则

    所选序列应该高度特异。应该选择具有最小二级结构的扩增子。这是很重要的,因为二级结构会影响反应效率。在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率,这意味着每次循环中,体系内的扩增子都有两倍的增加。如果二级结构在热力学上比寡聚目的基因更稳定,那目的基因的杂交将会失败。二级结构还会阻碍酶的扩增。如果扩增子的二级结构不能避免,则引物的退火温度要相应提高。在整个过程中,我们要进行BLAST和类似的分析,以确保特异性。

    通用原则
    1,先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。
    2,扩增子的长度应不超过400bp,理想的最好能在100-150bp内,扩增片断约短,有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性
    3,保持GC含量在20%和80%之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,及在SG分析中非特异信号。
    4,为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G)
    5,将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。

    b),探针设计指导
    1,在设计引物之前设计探针
    2,探针的Tm值应在68-70℃之间,如果是目测探针,则要仔细审查GC富含区。
    3,探针的5’端要避免有鸟氨酸,5’G会有淬灭作用,即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在
    4,选择C多于G的链作探针,G的含量多于C会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
    6,探针应尽可能的短,不要超过30个bp。
    7,检测探针的DNA折叠和二级结构。

    c), 引物设计指导
    1,引物的Tm值应在58-60℃之间,这非常重要,因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃,在这个温度下,5’核酸外切酶的活性最高。
    2,引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。
    3,将引物尽量接近于探针

    d循环参数
    当引物和探针按照上述原则设计好后,循环的参数也就确定了,当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定),反应要经过95℃,15-20秒,60℃60秒,对于一些模板,45秒也足够了。数据在退火时检测。

    e)怎么优化探针和引物的浓度
    对于双探针反应,通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果,,能获得最低的CT值,以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。

    引物浓度应该在50nM -900nM 范围内进行优化,下面的表格显示了前后引物9种可能浓度组合的结果
    探针浓度应该在50-250nM范围内优化
    前引物
    后引物50300900
    5050/50300/50900/50
    30050/300300/300900/300
    90050/900300/900900/900
    探针的浓度应该从(50,100,250nM)与9种引物浓度相组合,也既是27种可能根据前面所述的循环参数,在Rotor-Gene上进行试验,
    选择最小CT值和最高反应扩增的曲线做后续试验。
    g)进一步的提示
    通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM,绝大多数反应都可以在这个浓度下进行,但为了寻找最佳的浓度,还是应该依照上述的步骤。
    由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序,因此使用三种退火温度(58,60,62℃)对优化是很有用的。
    引物的浓度也会影响溶解温度,高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。
    Primer3是个非常有用的软件,但他不能避免3‘端的G,所以我们将3’端的G去除,并观察探针的退火温度是否比引物高8-10度。

    f)定量数据的分析
    分析定量数据主要有两种基本的方法
    i)绝对定量
    ii)相对定量
    研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据
    h)绝对定量
    绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析,一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品,关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论,理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得,然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因,并与未知样品比较。要注意得是,绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。

    在Rotro-Gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的,R值,反应效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整,(或重复相同的标准品),这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个标准曲线来说,一个单独的标准品就已经足够了。我们也可以在不同的通道甚至一个通道内绘制多条标准曲线。最后提到的功能主要是为了那些想用SYBR-Green分析两个基因的使用者。
    ii)相对定量
    相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较,其结果是一个比率。没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法(⊿⊿Ct)
    这种方法可以彻底不需要标准曲线,通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平(normalizer),从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功,目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看⊿Ct(相同的起始模板浓度,两个扩增子的两个CT值的差异)随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同,则the plot of log input amount versus ⊿Ct 将是一条水平线(斜率<0.01)。这以为着在初始模板浓度范围内,两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致,则应该用标准曲线来对基因表达进行定量,或优化反应使得获得一个类似的效率。动态范围应该有下面两点决定(1)目的基因使用最小和最大的浓度其结果都是准确的(2)两个基因的最小和最大的定量比值都是准确的)

全部回答(1)
  • 本回答由 北京索莱宝科技有限公司 提供

    2018-01-28 06:01:09 提交于 2018-01-28 06:01:09

    (转载,仅供参考)
    a)针对双标记探针的引物和探针设计的规则

    所选序列应该高度特异。应该选择具有最小二级结构的扩增子。这是很重要的,因为二级结构会影响反应效率。在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率,这意味着每次循环中,体系内的扩增子都有两倍的增加。如果二级结构在热力学上比寡聚目的基因更稳定,那目的基因的杂交将会失败。二级结构还会阻碍酶的扩增。如果扩增子的二级结构不能避免,则引物的退火温度要相应提高。在整个过程中,我们要进行BLAST和类似的分析,以确保特异性。

    通用原则
    1,先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。
    2,扩增子的长度应不超过400bp,理想的最好能在100-150bp内,扩增片断约短,有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性
    3,保持GC含量在20%和80%之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,及在SG分析中非特异信号。
    4,为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G)
    5,将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。

    b),探针设计指导
    1,在设计引物之前设计探针
    2,探针的Tm值应在68-70℃之间,如果是目测探针,则要仔细审查GC富含区。
    3,探针的5’端要避免有鸟氨酸,5’G会有淬灭作用,即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在
    4,选择C多于G的链作探针,G的含量多于C会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
    6,探针应尽可能的短,不要超过30个bp。
    7,检测探针的DNA折叠和二级结构。

    c), 引物设计指导
    1,引物的Tm值应在58-60℃之间,这非常重要,因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃,在这个温度下,5’核酸外切酶的活性最高。
    2,引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。
    3,将引物尽量接近于探针

    d循环参数
    当引物和探针按照上述原则设计好后,循环的参数也就确定了,当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定),反应要经过95℃,15-20秒,60℃60秒,对于一些模板,45秒也足够了。数据在退火时检测。

    e)怎么优化探针和引物的浓度
    对于双探针反应,通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果,,能获得最低的CT值,以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。

    引物浓度应该在50nM -900nM 范围内进行优化,下面的表格显示了前后引物9种可能浓度组合的结果
    探针浓度应该在50-250nM范围内优化
    前引物
    后引物50300900
    5050/50300/50900/50
    30050/300300/300900/300
    90050/900300/900900/900
    探针的浓度应该从(50,100,250nM)与9种引物浓度相组合,也既是27种可能根据前面所述的循环参数,在Rotor-Gene上进行试验,
    选择最小CT值和最高反应扩增的曲线做后续试验。
    g)进一步的提示
    通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM,绝大多数反应都可以在这个浓度下进行,但为了寻找最佳的浓度,还是应该依照上述的步骤。
    由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序,因此使用三种退火温度(58,60,62℃)对优化是很有用的。
    引物的浓度也会影响溶解温度,高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。
    Primer3是个非常有用的软件,但他不能避免3‘端的G,所以我们将3’端的G去除,并观察探针的退火温度是否比引物高8-10度。

    f)定量数据的分析
    分析定量数据主要有两种基本的方法
    i)绝对定量
    ii)相对定量
    研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据
    h)绝对定量
    绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析,一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品,关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论,理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得,然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因,并与未知样品比较。要注意得是,绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。

    在Rotro-Gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的,R值,反应效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整,(或重复相同的标准品),这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个标准曲线来说,一个单独的标准品就已经足够了。我们也可以在不同的通道甚至一个通道内绘制多条标准曲线。最后提到的功能主要是为了那些想用SYBR-Green分析两个基因的使用者。
    ii)相对定量
    相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较,其结果是一个比率。没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法(⊿⊿Ct)
    这种方法可以彻底不需要标准曲线,通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平(normalizer),从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功,目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看⊿Ct(相同的起始模板浓度,两个扩增子的两个CT值的差异)随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同,则the plot of log input amount versus ⊿Ct 将是一条水平线(斜率<0.01)。这以为着在初始模板浓度范围内,两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致,则应该用标准曲线来对基因表达进行定量,或优化反应使得获得一个类似的效率。动态范围应该有下面两点决定(1)目的基因使用最小和最大的浓度其结果都是准确的(2)两个基因的最小和最大的定量比值都是准确的)