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  • 天成用户

    提交于 2018-02-05 01:02:39

    N-末端测定
      A.二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年Sanger提出此方法,是他的重要贡献之一.
      DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后,通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸.Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸.
      B.氰酸盐法:1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N末端的新方法,步骤如下:
      由于乙内酰脲氨基酸不带电荷,因此可用离子交换层析法将它与游离氨基酸分开,分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解,重新生成游离的氨基酸,鉴别此氨基酸即可了解N-末端是何种氨基酸.
      C.二甲基氨基萘磺酰氯法:1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法,采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯,简称丹磺酰氯.它与游离氨基末端作用,方法类似于Sanger的DNFB法,产物是磺酰胺衍生物.
      丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光.此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍,样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高),可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定.

全部回答(4)
  • tinyzeal

    2018-01-30 10:01:07 提交于 2018-01-30 10:01:07

    囧。。。。分子克隆上写了几十页的东西,自己查查嘛
    表告诉我们你不知道啥是分子克隆。。。。
  • stp2000

    2018-01-31 23:01:16 提交于 2018-01-31 23:01:16

    检测N末端主要有3种方法:

    蛋白质的末端氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质(DNP-蛋白质)。产物黄色,可经受酸性100℃高温。水解时,肽链断开,但DNP基并不脱落。DNP-氨基酸能溶于有机溶剂(如乙醚)中,这样可与其他氨基酸和ε-DNP赖氨酸分开。再经双向滤纸层析或柱层析,可以鉴定黄色的DNP氨基酸。

    丹磺酰氯法是更灵敏的方法。蛋白质的末端氨基与5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反应,生成DNS-蛋白质。DNS-氨基酸有强荧光,激发波长在360nm左右,比DNFB法灵敏100倍。

    目前应用最广泛的是异硫氰酸苯酯(PITC)法。末端氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物,后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化,生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。产物可用气-液色谱法进行鉴定。这个方法最大的优点是剩下的肽链仍是完整的,可依照此法重复测定新生的N末端氨基酸。现在已经有全自动的氨基酸顺序分析仪,可测定含20个以上氨基酸的肽段的氨基酸顺序。缺点是不如丹磺酰氯灵敏,可与之结合使用。
  • hemiao5220

    2018-02-01 15:02:18 提交于 2018-02-01 15:02:18

    Eadam降解法是一种化学法对蛋白质进行测序的方法,是从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰,然后从多肽链上切下修饰的残基,再经层析鉴定,余下的多肽链(少了一个残基)被回收再进行下一轮降解循环。

    P. Edman降解测序主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。首先使用苯异硫氰酸酯(PITC)在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理,PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物,即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸处理,N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断,释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下来将该衍生物用有机溶剂(例如氯丁烷)从反应液中萃取出来,而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定,经酸作用,再进一步环化,形成一个稳定的苯乙内酰硫脲(PTH)衍生物,即PTH-氨基酸(下图)。
    留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程,整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。每一循环都获得一个PTH-氨基酸,经HPLC可以鉴定出是那一种氨基酸。Edman降解的最大优越性是在水解除去末端标记的氨基酸残基时,不会破坏余下的多肽链。
    当蛋白质中含有一个或多个半胱氨酸残基时,有时一对半胱氨酸残基会通过二硫键交联。在这种情况下测序,首先要经过处理(如用过甲酸处理)切断二硫键,然后再进行Edman降解测序。展开
  • 本回答由科学教育分类达人 程明推荐

    2018-02-05 01:02:39 提交于 2018-02-05 01:02:39

    N-末端测定
      A.二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年Sanger提出此方法,是他的重要贡献之一.
      DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后,通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸.Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸.
      B.氰酸盐法:1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N末端的新方法,步骤如下:
      由于乙内酰脲氨基酸不带电荷,因此可用离子交换层析法将它与游离氨基酸分开,分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解,重新生成游离的氨基酸,鉴别此氨基酸即可了解N-末端是何种氨基酸.
      C.二甲基氨基萘磺酰氯法:1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法,采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯,简称丹磺酰氯.它与游离氨基末端作用,方法类似于Sanger的DNFB法,产物是磺酰胺衍生物.
      丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光.此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍,样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高),可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定.