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  • 天成用户

    提交于 2018-02-16 00:02:51

    我曾经做过小分子和蛋白质的偶联,有一些自己总结的综述,你可以参考以下:
    人工抗原合成常用的载体
    载体表面应首先应具有化学活性基团,这些基团可以直接与抗生素(antibiotic)或农药分子偶联,这是化学偶联制备抗原的前提;其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子;载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能;而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的。
    常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。这些蛋白质分子中的α和ε-氨基(等电点8和10)、苯酚基、巯基(等电点为9)、咪唑基(等电点为7)、羧基(等电点2~4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基)等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合。当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境。牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HAS)分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度。此外,这些蛋白质在用有机溶剂(如吡啶、二甲基甲酰胺)溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质[30]。近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用[31,32]。
    1.2.2人工抗原合成方法
    小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响。通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行。一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下:
    1.2.2.1分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联
    1)混合酸酐法(mixed anhydride method):也称氯甲酸异丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下与氯甲酸异丁酯反应,形成混合酸酐的中间体,再与蛋白质的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物
    2)碳二亚胺法(CDI):碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物(见图1.5)。EDC被称作零长度交联剂之一,因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子。
    此连接方法十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌1~2h,置室温24h,再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基。在引入羧基后,也可用上述方法进行偶联。
    1.2.2.2含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
    1)戊二醛法:双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=Clt;,在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和,可在4~40℃及pH6.0~8.0内进行,操作亦简便,因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响,可能发生自我聚合,减弱其交联作用,因此最好使用新鲜的戊二醛。
    2)重氮化法:用于活性基团是芳香胺基的半抗原,芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐,它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上,形成一个偶氮化合物(见图1.6)。
    1.3.2.3含羟基半抗原的偶联
    1)琥珀酸酐法:半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半酯(带有羧基的中间体),再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合,在半抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基(图1.7)。
    2)羰基二咪唑法:N,N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂,在肽合成中首次表明了是形成极好的酰胺键试剂[33]。含羟基的分子同羰基二咪唑反应,形成中间体咪唑基甲酸酯,它能和N-亲核试剂反应,得到N-烷基化的甲酸酯键,通常蛋白质通过N-端(α-氨基)和赖氨酸侧链的(ε-氨基)和分子形成不带电的类似尿烷的衍生物,具有极好的化学稳定性。
    1.2.3影响人工抗原质量的因素
    人工抗原免疫原性的好坏,与多种因素有关。对不同的物质,影响免疫原性的因素并不完全相同,常常需要在得到抗体后对免疫偶合物的具体合成方法进行重新调整。但总的说来,影响人工抗原质量的因素主要有:
    1) 偶联比
    偶联比过去人们认为,联接到蛋白质分子上的半抗原数目要尽可能多。但实验证明,过多的半抗原并不能得到预期的结果,这是因为载体上覆盖的半抗原分子过多时,可能不利于载体与淋巴细胞表面结合,不能使载体引起免疫反应。实际上,每个载体分子连接上一个半抗原分子就足以产生抗体。有人认为,以BSA为例,连接到蛋白分子上的半抗原数以5~20为宜。而荣康泰等用不同的载体制备对氧磷的人工抗原时,却发现各种载体的分子量不论是否接近,最佳结合比都不尽相同,并建议为了取得最佳免疫效果,应逐个确定各种载体的最佳结合比。
    2) 偶联桥
    有研究者认为,一定长度的手臂的介入,有助于半抗原暴露在外面,利于所产生抗体专一性的增强,如吴颂如等[34]发现,通常愈远离载体蛋白的基团,其特征反应愈明显。但也有一些研究者发现,手臂结构对免疫检测经常有不利的影响,有时产生的抗体对手臂结构亲和力特别强,对待测小分子亲和力却很弱,因此造成对特异性抗体检测的干扰。Sionf等[35]认为可以采取两种方法来避免因偶联桥而造成的不足:一是半抗原上相同位点结合蛋白质,但免疫原和包被抗原用不同的偶联桥;二是免疫原和包被抗原用相同的偶联桥,但与不同半抗原位点结合。Frieia[36]研究农药酶免疫分析多年,他认为最好的偶联桥是3~6个直链的碳原子结构。
    3)半抗原的分子空间结构
    用来作半抗原的分子最好有分支结构,直链分子难以产生抗体。此外,有些抗生素(antibiotic)或农药有多个可供蛋白质偶联的位点,但据研究报道,不同位点与蛋白质结合制备的人工抗原产生的抗体效价及亲合力都有差别,这可能是因为不同位点结合导致半抗原呈现的空间结构不一样的原因。如合成灭草松和吡虫啉人工抗原时,当利用半抗原不同位点与载体结合时产生的抗体效价和亲合力明显不一样[37、38]。因此,如果一个分子内有多个不同的结合位点时,最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原,然后,通过比较,筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作为检测。
    1.2.4人工抗原的质量评定
    1.2.4.1浓度测定
    人工抗原的绝对含量常以蛋白质的相对浓度表示(如每ml抗原溶液中含有蛋白质多少mg)。因此测定人工抗原的浓度与测定人工抗原溶液中蛋白质的相对含量(mg/ml)是一致的(这里也反映出人工抗原越纯,检出的浓度值愈准确)。常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和荧光法等。这里就不一一介绍了。

    1.2.4.2纯度鉴定和结构分析
    鉴定农药人工抗原最常用的方法是紫外光谱扫描法,如果人工抗原的紫外吸收图谱不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱,则可初步证明人工抗原合成成功。
    半抗原与载体分子反应后是否真正的连接在一起,如果发生连接,它们的连接基团又在哪里。这些问题可以通过红外吸收光谱图或质谱分析得到解决。
    利用吸附与分配层析和电泳技术可鉴定人工抗原的偶联的纯度。前者适应范围广,但鉴别的灵敏度较低。后者是用于大分子大分子酶标记物和某些半抗原偶联物的纯度鉴定。如果电泳图谱上只出现一条电泳带,则表明人工抗原达到电泳纯,否则说明人工抗原中含有有利的未偶联的物质。

    1.2.4.3偶联比的测定
    1)分光光度法
    根据赵肃清等人的说法[39],如果半抗原的紫外最大吸收大于220nm(蛋白质在220nm以下会产生肽的强紫外吸收,如果半抗原的紫外最大吸收少于220nm,则与蛋白质肽的吸收发生重叠),则可根据蛋白质及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩尔消光系数,计算出结合到每个蛋白质分子上的半抗原分子数(可以参考文献[30]中的279-283页计算)。
    2)标记抗原示踪法
    在制备半抗原-蛋白质结合物时,向反应液中同时加入一定量的标记半抗原,反应完成后,未结合的半抗原经透析除去,测定透析前后的放射性强度,就可以计算出结合百分比。再依反应时加入的蛋白质摩尔数即可知半抗原结合到蛋白质上的分子数。如果不用透析,也可取一定量反应后的溶液,加入蛋白质沉淀剂或有机溶剂以提取结合的半抗原,测定半抗原-蛋白质结合物的放射性。同样可以计算出半抗原与蛋白质的偶联比。

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  • 天马行空设计_2

    2018-02-16 00:02:51 提交于 2018-02-16 00:02:51

    我曾经做过小分子和蛋白质的偶联,有一些自己总结的综述,你可以参考以下:
    人工抗原合成常用的载体
    载体表面应首先应具有化学活性基团,这些基团可以直接与抗生素(antibiotic)或农药分子偶联,这是化学偶联制备抗原的前提;其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子;载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能;而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的。
    常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。这些蛋白质分子中的α和ε-氨基(等电点8和10)、苯酚基、巯基(等电点为9)、咪唑基(等电点为7)、羧基(等电点2~4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基)等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合。当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境。牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HAS)分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度。此外,这些蛋白质在用有机溶剂(如吡啶、二甲基甲酰胺)溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质[30]。近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用[31,32]。
    1.2.2人工抗原合成方法
    小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响。通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行。一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下:
    1.2.2.1分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联
    1)混合酸酐法(mixed anhydride method):也称氯甲酸异丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下与氯甲酸异丁酯反应,形成混合酸酐的中间体,再与蛋白质的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物
    2)碳二亚胺法(CDI):碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物(见图1.5)。EDC被称作零长度交联剂之一,因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子。
    此连接方法十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌1~2h,置室温24h,再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基。在引入羧基后,也可用上述方法进行偶联。
    1.2.2.2含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
    1)戊二醛法:双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=Clt;,在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和,可在4~40℃及pH6.0~8.0内进行,操作亦简便,因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响,可能发生自我聚合,减弱其交联作用,因此最好使用新鲜的戊二醛。
    2)重氮化法:用于活性基团是芳香胺基的半抗原,芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐,它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上,形成一个偶氮化合物(见图1.6)。
    1.3.2.3含羟基半抗原的偶联
    1)琥珀酸酐法:半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半酯(带有羧基的中间体),再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合,在半抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基(图1.7)。
    2)羰基二咪唑法:N,N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂,在肽合成中首次表明了是形成极好的酰胺键试剂[33]。含羟基的分子同羰基二咪唑反应,形成中间体咪唑基甲酸酯,它能和N-亲核试剂反应,得到N-烷基化的甲酸酯键,通常蛋白质通过N-端(α-氨基)和赖氨酸侧链的(ε-氨基)和分子形成不带电的类似尿烷的衍生物,具有极好的化学稳定性。
    1.2.3影响人工抗原质量的因素
    人工抗原免疫原性的好坏,与多种因素有关。对不同的物质,影响免疫原性的因素并不完全相同,常常需要在得到抗体后对免疫偶合物的具体合成方法进行重新调整。但总的说来,影响人工抗原质量的因素主要有:
    1) 偶联比
    偶联比过去人们认为,联接到蛋白质分子上的半抗原数目要尽可能多。但实验证明,过多的半抗原并不能得到预期的结果,这是因为载体上覆盖的半抗原分子过多时,可能不利于载体与淋巴细胞表面结合,不能使载体引起免疫反应。实际上,每个载体分子连接上一个半抗原分子就足以产生抗体。有人认为,以BSA为例,连接到蛋白分子上的半抗原数以5~20为宜。而荣康泰等用不同的载体制备对氧磷的人工抗原时,却发现各种载体的分子量不论是否接近,最佳结合比都不尽相同,并建议为了取得最佳免疫效果,应逐个确定各种载体的最佳结合比。
    2) 偶联桥
    有研究者认为,一定长度的手臂的介入,有助于半抗原暴露在外面,利于所产生抗体专一性的增强,如吴颂如等[34]发现,通常愈远离载体蛋白的基团,其特征反应愈明显。但也有一些研究者发现,手臂结构对免疫检测经常有不利的影响,有时产生的抗体对手臂结构亲和力特别强,对待测小分子亲和力却很弱,因此造成对特异性抗体检测的干扰。Sionf等[35]认为可以采取两种方法来避免因偶联桥而造成的不足:一是半抗原上相同位点结合蛋白质,但免疫原和包被抗原用不同的偶联桥;二是免疫原和包被抗原用相同的偶联桥,但与不同半抗原位点结合。Frieia[36]研究农药酶免疫分析多年,他认为最好的偶联桥是3~6个直链的碳原子结构。
    3)半抗原的分子空间结构
    用来作半抗原的分子最好有分支结构,直链分子难以产生抗体。此外,有些抗生素(antibiotic)或农药有多个可供蛋白质偶联的位点,但据研究报道,不同位点与蛋白质结合制备的人工抗原产生的抗体效价及亲合力都有差别,这可能是因为不同位点结合导致半抗原呈现的空间结构不一样的原因。如合成灭草松和吡虫啉人工抗原时,当利用半抗原不同位点与载体结合时产生的抗体效价和亲合力明显不一样[37、38]。因此,如果一个分子内有多个不同的结合位点时,最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原,然后,通过比较,筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作为检测。
    1.2.4人工抗原的质量评定
    1.2.4.1浓度测定
    人工抗原的绝对含量常以蛋白质的相对浓度表示(如每ml抗原溶液中含有蛋白质多少mg)。因此测定人工抗原的浓度与测定人工抗原溶液中蛋白质的相对含量(mg/ml)是一致的(这里也反映出人工抗原越纯,检出的浓度值愈准确)。常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和荧光法等。这里就不一一介绍了。

    1.2.4.2纯度鉴定和结构分析
    鉴定农药人工抗原最常用的方法是紫外光谱扫描法,如果人工抗原的紫外吸收图谱不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱,则可初步证明人工抗原合成成功。
    半抗原与载体分子反应后是否真正的连接在一起,如果发生连接,它们的连接基团又在哪里。这些问题可以通过红外吸收光谱图或质谱分析得到解决。
    利用吸附与分配层析和电泳技术可鉴定人工抗原的偶联的纯度。前者适应范围广,但鉴别的灵敏度较低。后者是用于大分子大分子酶标记物和某些半抗原偶联物的纯度鉴定。如果电泳图谱上只出现一条电泳带,则表明人工抗原达到电泳纯,否则说明人工抗原中含有有利的未偶联的物质。

    1.2.4.3偶联比的测定
    1)分光光度法
    根据赵肃清等人的说法[39],如果半抗原的紫外最大吸收大于220nm(蛋白质在220nm以下会产生肽的强紫外吸收,如果半抗原的紫外最大吸收少于220nm,则与蛋白质肽的吸收发生重叠),则可根据蛋白质及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩尔消光系数,计算出结合到每个蛋白质分子上的半抗原分子数(可以参考文献[30]中的279-283页计算)。
    2)标记抗原示踪法
    在制备半抗原-蛋白质结合物时,向反应液中同时加入一定量的标记半抗原,反应完成后,未结合的半抗原经透析除去,测定透析前后的放射性强度,就可以计算出结合百分比。再依反应时加入的蛋白质摩尔数即可知半抗原结合到蛋白质上的分子数。如果不用透析,也可取一定量反应后的溶液,加入蛋白质沉淀剂或有机溶剂以提取结合的半抗原,测定半抗原-蛋白质结合物的放射性。同样可以计算出半抗原与蛋白质的偶联比。