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肝素-Sepharose CL-2B 的制备实验

发布时间:2018-11-15 10:34:06 阅读量:153次



试剂、试剂盒
实验步骤
材料

SepharoseCL-2B(PharmaciaBiotech,Inc.)

乙腈

溴化氰(CNBr)(AldrichChemicalCo.C9149-2)

甘氨酸

NaOH

肝素(钠盐;USP 级;制自猪肠粘液,140U/mg)[LifeTechnologies,Inc.(GIBCO/BRL)15077-027〕(每次制备需要 500000U)

试剂

Na2CO3(2mol/L)

NaHCO3(0.1 ml/L;PH9.5)

NaHCO3(0.2mol/L;pH8.5)

盐酸乙醇胺 (1mol/L;pH8.0)

NaAc(0.1mol/L;pH4.0)/NaCl 0.5mol/L)

尿素 (2mol/L)/NaCl(0.5mol/L)

NaHCO3(0.lmol/L;pH10.0)/NaCl3(0.5 ml/L)

Tris-HCl(100mmol/L;pH7.9)/EDTA(2 mmol/L)/叠氮钠 (0,04%,w/v)

(配方,见”试剂的配制“,pp.131~138)

操作程序

本方案是根据 March 等(1974) 方法改进而成。

1) 用至少 1000 ml 重蒸水洗涤 250 mlSepharoseCL-2B(以床体积计)
注:操作 SepharoseCL-2B 要轻缓,以免损伤琼脂糖凝胶颗粒。

2) 于 2000-ml 塑料烧杯中,将 250 ml 洗过的 SepharoseCL-2B 和 750 ml 2mol/LNa2CO3 混合,用磁力搅拌器搅拌。

3) 在通风橱中,将 12.5 ml 乙腈加入 25 g 溴化氰中,用玻璃榉搅拌溶解。

4) 室温下,用巴氏吸管将溴化镢溶液转移至搅拌着的 SepharoseCL-2B 中。

5) 室温下,混合物搅拌 2 min。

6) 将混合物转移至 600-ml 粗烧结玻板漏斗,快速、温和地用 1000ml 0.1mol/LNaHCO3(pH9.5)、1000 ml 重蒸水和 1000 ml 0.2mol/LNaHC3(pH8.5) 洗涤混合物。
注:不要让溴化氰活化好的胶干成饼状!
滤液中加入 20 g 甘油和 20 g NaOH, 于通风橱中放置过夜后弃去。

7) 于 500-ml 塑料瓶中,将 3 g 肝素(500000U) 溶于 250 ml 0.2mol/LNaHCO3(PH8.5) 中。
注:从不同厂商买来的肝素制品用于肝素-琼脂糖层析时,其性质有很大不同。事实上,有些肝素制品用于肝素-琼脂糖层析时是完全无效的,当然,我们也不是非用"材料"一节所列的特定来源 GIBCO/BRL) 的肝素制品不可。

8) 将经溴化氰活化的胶转移至含肝素溶液的 500-ml 塑料瓶中(所有溶液均应置室温下)。

9)4°C 下混合 20 h。

10)通过烧结玻板漏斗过滤收集肝素-Sepharose 胶。用 400 ml1moI/L 盐酸乙醇胺 (pH8.0) 悬浮,室温下至少混合 4 h。

11) 分别用 2000 ml0.lmol/LNaOAc(pH4.0)/0.5mol/LNaCl、2000 ml2mol/L 尿素/0.5mol/LNaCl、2000 ml 0.1mol/LNaHCO3(pH10.0)/0.5mol/LNaCl 和 2000 ml 重蒸水洗胶。

12) 将制备好的胶悬浮于 250 ml100 mmol/LTris-HCl(pH7.9)/2 mmol/LEDTA/0.04% 叠氮钠中。
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