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DNA 酶 I 足迹分析实验

发布时间:2018-11-15 10:34:05 阅读量:166次



试剂、试剂盒
实验步骤
材料

32P-标记 DNA 酶 I 足迹探针

酚/氯仿(1:1;v/v)

乙醇(100% 和 75%;v/v)

试剂

聚乙烯醇(10%;w/v)

竞争 DNA

缓冲液 Z'(或缓冲液 Ze)

DNA 酶 I(2,5 mg/ml)

MgCl2(10 mmol/L)/CaCl2(5 mmol/L)

DNA 酶 I 终止液

蛋白酶 K(2.5 mg/ml)

甲酰胺加样缓冲液

(配方,见“试剂的配制”,PP.131~138)

操作程序

1)1.5-ml 塑料微量离心管置冰上预冷。加入 DNA 酶 I 终止液前可不必盖盖,(见步骤 11,P.124)

2) 按如下配方配制供所有反应用的组合探针 DNA 混合物:

1X 探针 DNA 混合物(用于一次反应)

32P-标记 DNA 探针                                                                                   Xul

聚乙烯醇 (10%)                                                                                         10ul

小牛胸腺 DNA(1 mg/ml);poly(dI-dC)、poly(dG-dC)、                                0.2~1ul

或 poly(dA,dT)(10A260nm 单位;或不含竞争 DNA(用于

纯的或近似纯的蛋白质)。对 S-300 柱组分(10ul), 用

(0.2ul10A260nm 单位 poly(dI-dC)

H20                                                                                                             Zul

总体积                                                                                                         25ul

震荡,使探针 DNA 混合物彻底混匀。聚乙烯醇较粘稠,只有充分震荡才能使探针 DNA 溶液完全混合。
注:1. 聚乙烯醇可能会促进因子与 DNA 的结合。它大概是作为“分子拥挤剂(molecularcroudingagent)"而起作用的,分子拥挤剂 [”体积排阻剂(volumeexcluder)“] 可加大分子如蛋白质和 DNA 的有效浓度(可把它想象成分子海绵,它只吸水和小离子而不吸大分子 2. 竞争 DNA 可用可不用,但分析粗制的蛋白质组分时,用竞争 DNA 常常是有益的。
注意,加入竞争 DNA 的时间可能是一个重要参数。一般,竞争 DNA 与探针混合物一起加人,如本方案中 AP-1 的足迹分析。不过,在某些情况下,加入蛋白质组分和探针混合后再在毎个管中分别加入竞争 DNA, 可能会更好座。加入竞争 DNA 的最适时间应由实验定。

3) 于每个反应管中加入适量的缓冲液 Z'十 0.1mol/LKC1 和缓冲液 Z'+0.0mI/LKCl。
注:缓冲液 Z'+蛋白质组分混合物的终体积应为 25ul, 混合物中 KCl 的终浓度应为 0.1mol/L。例如,若用足迹法分析 5ul 含 0.3mol/L 的蛋白质组分,需加入 10ul 缓冲液 Z'+0.0 ml/LKCl 和 10ul 缓冲液 Z'+0.1mol/LKCl, 以使盐的终浓度为 0.1mol/LKC1。

4) 将蛋白质组分直毕加于装有适量适当类型 (0.0moI/LKCl 或 0.1mol/LKC1) 的缓冲液 Z'的 f 反应管中。

5) 每个反应管中加入 25ul 探针 DNA 混合物,轻弹混合样品,置冰上孵育 15 min。同时,取一份 2.5 mg/ml DNA 酶 I 储液解冻。

7) 探针 DNA 和蛋白质组分孵育 15 min,临结束前,用冰预冷的水稀释 DMA 酶Ⅰ。然后颠倒并温和震荡,使之彻底混匀。
注:对于不含蛋白质的阴性对照反应,2ul 1:2000 倍稀释的 DNA 酶 I 可用于大多数 DNA 探针。而对于持定的 DNA 序列,DNA 酶 I 的最适用量可因序列不同而异,对与不纯蛋白质的反应,由于可能存在 DNAIII 抑制剂如肌动蛋白单体,通常需要多加一点 DNA 酶 I。粗制的蛋白质组分需要比正常多 20~100 倍的 DNASI。部分纯化的蛋白质组分需要比正常多 3~10 倍的 DMA 酶 I。纯的蛋白质组分不需要任何过量的 DNA 酶 I。对每个待分析的蛋白质组分,均必须确定其最适的 DNA 酶 I 稀释度。

8)从冰上取下一份 DNA 探针和蛋白质组分样品,室温放置 1 min。
注;足迹分析时,所有必需的东西自动移液器、溶液、定时器、震荡器,DNA 酶Ⅰ)均井然有序地摆放在--起是有益的。本操作程序进行得越顺当,足迹分析的结果将会越好(且重复性也越好)。

9) 于反应管中加入 50ul 10 mmol/L MgCl2 5 mmol/L CaCl2 溶液(室温),轻弹混合。于室温放置 1 min。

10) 于反应管中加入稀释的 DNA 酶 I 立刻轻弹混合。室温孵育 lmin。
注:粗制蛋白质组分中的内源性核酸酶会改变 DNA 酶 I 的消化梯。因此,在对粗提物进行足迹分析时,应包括只含提取物而不加 DNA 酶Ⅰ的对照反应。

11) 加 90ulDNA 酶 I 终止液。震荡混合。
注:通常,每个周期分析三个(或更多个)样品,下面的例子叙述了如何同时进行三个样品的分析。



12)(本步可任选)所有样品的足迹反应都完成后,加入 10ul2.5 mg/ml 蛋白酶 K, 温和震荡混合,室温放置 5 min。这一步对蛋白质的粗提物很有用,但对纯的蛋白质则不是必需的。(本步可任选)

13) 为制备电泳样品,可加 200ul1:1 酚/氯仿。震荡混合。离心 5 min。

14) 上层转移至一新管。加 800ul100% 乙醇。颠倒混合,离心 15 min, 沉淀核酸。

15) 移去上清。加 800ul75% 乙醇。震荡混合。离心 5 min。

16) 移去上清。用 SpeedVac 旋转浓缩器干燥沉淀物。

17) 加 9ul 甲酰胺加样缓冲液,震荡溶解沉淀物。

18) 煮沸 3 min, 置冰上冷却。

19) 离心 0.5s, 使溶液沉至管底。震荡混合。加样 4ul 于序列分折胶上。
注:为确定蛋白结合位点的位置,可将 DNA 酶 I 的酶切样品加在邻接于 Maxam-Gilbert 测序梯(sequencingladder)(由足迹探针制备)的泳道上。