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二喹啉甲酸(BCA)检测法测定蛋白质浓度实验一二奎琳甲酸检测法

发布时间:2018-11-15 10:34:03 阅读量:233次



实验方法原理

在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构能与 Cu2+络合生成络合物,同时将 Cu2+还原成 Cu。而 BCA 试剂可敏感特异地与结合,形成稳定的有颜色的复合物。 在 562nm 处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含童。

实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤

1. 溶液


1.1 试剂 A,1L

10 g BCA (1%)

20 g Na2CO3·H2O) (2%)

1.6 g Na2C4H4O6(·2 H2O) (0.16%)

4 g NaOH (0.4%)

9.5 g NaHCO3 (0.95)

加水至 1L,用 NaOH 或固体 NaHCO3 调节 pH 值至 11.25。


1.2 试剂 B,50 ml

2 g CuSO4·5 H2O(4%)

加双蒸水至 50 ml

试剂 A 和试剂 B 在室温下至少稳定 12 个月,并可购买商品化试剂。


1.3 标准工作试剂(SWR)

50 份试剂 A

1 份试剂 B

可稳定一周。


2. 检测


2.1 将 1 倍体积样品与 20 倍体积的 SWR 混合(例如:100 ul 样品加入 2 ml SWR);


2.2 在室温孵育 2 h(a)或 37℃ 30 min(b);


2.3 在(b)情况下冷至室温;


2.4 在 562 nm 读取光密度(OD) 值。

注意事项

1. 为促进 BCA 法的反应进程,可将实验试管置于微波炉中孵台 20s 以内。


2. 在样品冷却至室温后。 每 10 min 光吸收值升高 2.3%。


3. BCA 法检测微量蛋白灵敏度 0.5~10 ug/ml,应采用浓缩试剂,并需要在 60℃ 反应 60 min。


4. 与 Lowry 法相比,采用 BCA 法时,如果样品中含有脂类物质将明显提高光吸收值。


5. 在含巯基试剂和去垢剂的缓冲液中 BCA 呈色发生变化。


6. 蛋白质样品经 DOC-TCA 沉淀后,会去除多数干扰物质。

其他