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发布时间：2018-11-15 10:34:03 阅读量：984次
| 实验方法原理 |
在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构能与 Cu2＋络合生成络合物，同时将 Cu2＋还原成 Cu＋。而 BCA 试剂可敏感特异地与结合，形成稳定的有颜色的复合物。 在 562nm 处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含童。 |
|---|---|
| 实验材料 |
待测蛋白质样品 |
| 试剂、试剂盒 |
BCA NaOH 碳酸钠 碳酸氢钠 五水硫酸铜 酒石酸钠 |
| 仪器、耗材 |
分光光度计 37℃ 水浴锅 小烧杯 移液管 枪头和加样枪 试管 试管架 |
| 实验步骤 |
1. 溶液 1.1 试剂 A，1L 10 g BCA （1％） 20 g Na2CO3·H2O） （2％） 1.6 g Na2C4H4O6（·2 H2O） （0.16％） 4 g NaOH （0.4％） 9.5 g NaHCO3 （0.95） 加水至 1L，用 NaOH 或固体 NaHCO3 调节 pH 值至 11.25。 1.2 试剂 B，50 ml 2 g CuSO4·5 H2O（4％） 加双蒸水至 50 ml 试剂 A 和试剂 B 在室温下至少稳定 12 个月，并可购买商品化试剂。 1.3 标准工作试剂（SWR） 50 份试剂 A 1 份试剂 B 可稳定一周。 2. 检测 2.1 将 1 倍体积样品与 20 倍体积的 SWR 混合（例如：100 ul 样品加入 2 ml SWR）； 2.2 在室温孵育 2 h（a）或 37℃ 30 min（b）； 2.3 在（b）情况下冷至室温； 2.4 在 562 nm 读取光密度（OD） 值。 |
| 注意事项 |
1. 为促进 BCA 法的反应进程，可将实验试管置于微波炉中孵台 20s 以内。 2. 在样品冷却至室温后。 每 10 min 光吸收值升高 2.3％。 3. BCA 法检测微量蛋白灵敏度 0.5～10 ug/ml，应采用浓缩试剂，并需要在 60℃ 反应 60 min。 4. 与 Lowry 法相比，采用 BCA 法时，如果样品中含有脂类物质将明显提高光吸收值。 5. 在含巯基试剂和去垢剂的缓冲液中 BCA 呈色发生变化。 6. 蛋白质样品经 DOC-TCA 沉淀后，会去除多数干扰物质。 |
| 其他 |
|
