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制备电泳实验一等电聚焦制备电泳

发布时间:2018-11-15 10:34:02 阅读量:154次



实验方法原理 等电聚焦制备电泳是一种非变性制备技术。由于等电聚焦电泳技术的特点,因而是一种理想的制备方法。
试剂、试剂盒
实验步骤
一、液体介质

垂直柱状蔗糖密度梯度等电聚焦是原瑞典 LKB 公司早期用于制备和分析目的的等电聚焦方法。载体两性电解质在蔗糖密度梯度柱中形成 pH 梯度,样品根据它们的等电点进行分离,使用这种方法所需的时间较长。

有些也使用液体介质进行制备等电聚焦。但它是水平圆柱状方式,分成  20 个腔。腔间用单丝聚酯筛做成的膜隔开,据称使用这种方法所需的分离时间只要 4 小时左右,上样量可达 4 g。

二、凝胶介质

使用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行制备等电聚焦可以得到很好的分辨率,但是凝胶孔径小,分离后的洗脱比较困难,所以在凝胶介质中的制备等电聚焦大都采用专门纯化后的 Sephadex,LKB 公司将此称为 “Ultrodex”(颗粒凝胶 )。它带电少,机械性能好,电渗效应弱,清洗后可重复使用。一般水平电泳仪均可使用凝胶介质进行制备等电聚焦。

三、方法

1. 电极液,固定,染色和脱色液的配置同 “载体两性两解质 pH 梯度等电聚焦”。

2. 95 ml 去盐的样品液加 5 ml 载体两性电解质。

3. 将 4 g Ultrodex 慢慢地加入上述的溶液中,边加边搅拌,溶解后称重。

4. 将凝胶和样品溶液倒入制备盘中,轻敲,使凝胶均匀分布在盘中,见图 12.1。称烧杯和剩余胶液的重量。



5. 打开胶盘上方 70 cm 处的小风扇,吹胶,使水分蒸发。见图 12.2,吹胶一段时间后,称重。根据 Ultrodex 瓶上标明的蒸发限, 可推算出应蒸发掉的水的重量。室温下,一般要吹 3~4 小时,方可蒸发掉合适的水量。胶中的含水量十分重要,若过高,聚焦后蛋白区带易沉积在胶床底部。纸印时,滤纸因未黏上蛋白而无法显色,且凝胶中的蛋白带成波浪状。含水量过低,则胶床开裂。



为了缩短电泳时间和提高分辨率,胶液中可以先不要加样品,吹胶后,将等电点附近的凝胶挖出和样品混在一起,再加在原处,见图 12.3。



6. 一定量的水蒸发后,关掉小风扇。在水平电泳槽的冷却板上加一些 0.1% Triton X-100。小心将胶盘移至冷却板上,排除气泡,使胶盘和冷却板很好地接触,以利热传导。将分别浸湿阴、阳两极电极液的电极条分别置于阴、阳两极。连接电极,接通电源,开始电泳。电泳可使用恒功率方式,电压缓慢上升,电流不断下降,一般应电泳过夜。

7. 电泳结束后,用一张干净滤纸从胶盘一端盖满胶面且不留气泡,约 1 分钟后小心将滤纸揭下。与凝胶接触的面朝上,放于玻璃板上用冷风吹干,将滤纸按需要染色,这就是所谓的 “纸印” 技术。可以纸印几张滤纸,以不同方法染色,以确认感兴趣蛋白的位置。

8. 如需要,用表面电极测定凝胶中 pH 梯度。

9. 将印有蛋白条带的滤纸,置于胶盘下,在灯箱上观察。根据滤纸上蛋白条带的位置,用不锈钢勺将所需条带逐一取出,各自放入相应的洗脱小柱中。取胶时动作应迅速,并应取完全,以保证产率。

10. 在洗脱小柱中加入适量的洗脱缓冲液,缓冲液体积过小,洗脱不充分,影响产率。洗脱液体积过大会给浓缩带来困难。洗脱小柱的底部有一筛孔膜,纯化的蛋白质将随缓冲液流下,胶则留在膜上。

11. 载体两性电解质无毒,分子质量约为 1000 Da 左右。在很多情况下可起到稳定蛋白质的作用,且为可逆性结合,所以可用透析、超滤、硫酸铵沉淀,层析等方法去除样品溶液中的载体两性电解质。