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蛋白质印迹实验一从SDS凝胶上转移蛋白质

发布时间：2018-11-15 10:34:01 阅读量：804次

试剂、试剂盒	甘氨酸 Tris SDS 甲醇
实验步骤	1. 溶液配置 (1) 连续缓冲系统甘氨酸 39 mmol/L；Tris 48 mmol/L；SDS 0.0375% ( W/V)；甲醇 20% (V/V)。溶液均需用双蒸水配置。这个缓冲系统可用作阳极缓冲液，也可用作阴极缓冲液。 (2) 不连续缓冲系统阳极缓冲液Ⅰ：0.3 mol/L Tris，pH 10.4，20% 甲醇。阳极缓冲液Ⅱ：25 mmoI/L Tris，pH 10.4，20% 甲醇。阴极缓冲液：4 mmol/L 6-氨基-n-己酸，pH 7.6，20% 甲醇。缓冲液中的甲醇可以防止 SDS 凝胶的肿胀，但由于它的固定作用可能使蛋白质变性，结果导致转移效率降低。反之，甲醇由于增强疏水反应可能增加蛋白与硝化纤维素膜的结合能力。 2. 转移单元的组成先将凝胶从支持膜上剥离下来，如图 11.6 组成转移单元。如使用连续缓冲系统，阳、阴极侧滤纸使用相同缓冲液。如使用不连续缓冲系统，第一层的 6 张滤纸用阳极液Ⅰ浸湿并放在阳极板上。如有多个转移单元时，第一层的 3 张滤纸用阳极液Ⅱ浸湿，每个单元的最后 3 张滤纸和邻近阴极板的 6 张滤纸用阴极液浸湿。操作时应带手套。每层之间要避免气泡。为了确保电流仅仅通过凝胶，要使所有转移单元的组成都与被转移的凝胶有同样的大小。相同形式和大小的几块凝胶能同时把一个单元堆在另一个单元上进行转移。可同时转移的单元数取决于仪器的性能。在单元之间要放一张玻璃纸透析膜，以防止转移单元之间的交叉污染。 3. 电参数转移时的电流为 0.8 mA/cm²。SDS 凝胶转移所需的时间约为 0.5~1 小时。取决于固定化材料和缓冲液的选择，仪器的性能等。

试剂、试剂盒

实验步骤

1. 溶液配置

(1) 连续缓冲系统

甘氨酸 39 mmol/L；Tris 48 mmol/L；SDS 0.0375% ( W/V)；甲醇 20% (V/V)。溶液均需用双蒸水配置。这个缓冲系统可用作阳极缓冲液，也可用作阴极缓冲液。

(2) 不连续缓冲系统

阳极缓冲液Ⅰ：0.3 mol/L Tris，pH 10.4，20% 甲醇。

阳极缓冲液Ⅱ：25 mmoI/L Tris，pH 10.4，20% 甲醇。

阴极缓冲液：4 mmol/L 6-氨基-n-己酸，pH 7.6，20% 甲醇。

缓冲液中的甲醇可以防止 SDS 凝胶的肿胀，但由于它的固定作用可能使蛋白质变性，结果导致转移效率降低。反之，甲醇由于增强疏水反应可能增加蛋白与硝化纤维素膜的结合能力。

2. 转移单元的组成

先将凝胶从支持膜上剥离下来，如图 11.6 组成转移单元。如使用连续缓冲系统，阳、阴极侧滤纸使用相同缓冲液。如使用不连续缓冲系统，第一层的 6 张滤纸用阳极液Ⅰ浸湿并放在阳极板上。如有多个转移单元时，第一层的 3 张滤纸用阳极液Ⅱ浸湿，每个单元的最后 3 张滤纸和邻近阴极板的 6 张滤纸用阴极液浸湿。操作时应带手套。每层之间要避免气泡。为了确保电流仅仅通过凝胶，要使所有转移单元的组成都与被转移的凝胶有同样的大小。相同形式和大小的几块凝胶能同时把一个单元堆在另一个单元上进行转移。可同时转移的单元数取决于仪器的性能。在单元之间要放一张玻璃纸透析膜，以防止转移单元之间的交叉污染。

3. 电参数

转移时的电流为 0.8 mA/cm²。SDS 凝胶转移所需的时间约为 0.5~1 小时。取决于固定化材料和缓冲液的选择，仪器的性能等。

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