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Autophagy(自噬)

发布时间:2013-08-23 00:00:00 阅读量:50119次



自噬是近年来很热门的领域,搜了一下园子,发现没有这方面系统的介绍或讨论,但很多战友有这方面的疑问,加上本人最近对此也非常感兴趣,因此,借本版来专门讨论一下自噬(说实在的,自噬属于丁香园哪一个版块的范围我也选不好),与各位同行或有志于研究自噬的战友共同学习,也欢迎大家提出自己的看法,本人的目的就是交流。

自噬的过程——从一张图片开始:
步骤1:细胞接受自噬诱导信号后,在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构,然后不断扩张,但它并不呈球形,而是扁平的,就像一个由2层脂双层组成的碗,可在电镜下观察到,被称为Phagophore,是自噬发生的铁证之一。
步骤2:Phagophore不断延伸,将胞浆中的任何成分,包括细胞器,全部揽入“碗”中,然后“收口”,成为密闭的球状的autophagosome,我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征:一是双层膜,二是内含胞浆成分,如线粒体、内质网碎片等。
步骤3:自噬体形成后,可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合(加了个“可”字,意思是这种情况不是必然要发生的)。
步骤4:自噬体与溶酶体融合形成autolysosome,期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解,2者的内容物合为一体,自噬体中的“货物”也被降解,产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
透射电镜下自噬的照片:
自噬的特性:
(1)自噬是细胞消化掉自身的一部分,即self-eating,初一看似乎对细胞不利。事实上,细胞正常情况下很少发生自噬,除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多,也是研究的热门。既有来自于细胞外的(如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等),也有细胞内的(代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等)。由于这些因素的经常性存在,因此,细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。
(2)自噬过程很快,被诱导后8min即可观察到自噬体(autophagosome)形成,2h后自噬溶酶体(autolysosome)基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。
(3)自噬的可诱导特性:表现在2个方面,第一是自噬相关蛋白的快速合成,这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成,这是执行阶段。
(4)批量降解:这是与蛋白酶体降解途径的显著区别
(5)“捕获”胞浆成分的非特异性:由于自噬的速度要快、量要大,因此特异性不是首先考虑的,这与自噬的应急特性是相适应的。
(6)自噬的保守性:由于自噬有利于细胞的存活,因此无论是物种间、还是各细胞类型之间(包括肿瘤细胞),自噬都普遍被保留下来(谁不喜欢留一手呢?)。

自噬相关基因(autophagy associated gene, ATG):在自噬过程中到底有哪些蛋白的参与,即自噬相关蛋白的鉴定是目前自噬研究主要的任务。由于自噬研究的历史关系,很多基因在酵母和哺乳动物中有不同的命名。

自噬过程的调控:
从上面总结的自噬特点中可以看出,自噬这一过程一旦启动,必须在度过危机后适时停止,否则,其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察,任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。

目前,已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬,如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等,这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。

关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有:
抑制类
(1)Class I PI3K pathway (PI——phosphatidylinositol,磷脂酰肌醇)与IRS (Insulin receptor substrate) 结合,接受胰岛素受体传来的信号(血糖水平高抑制自噬)。

(2)mTOR在人类中的同源基因是FRAP1(FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1),是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。能接受多种上游信号,如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK,能感受营养和能量的变化。

激活类
(1)Class III PI3K
结构上类似于Class I PI3K,但作用相反。

接受上述信号的自噬蛋白:
目前都把焦点集中在beclin 1(酵母同源物为atg6),能与多种蛋白结合,如Vps34(Class III PI3K的催化亚单位),mTOR,BCL-2和BCLXL蛋白等,需注意的是,beclin-1是一个多功能蛋白,除了接受自噬信号,它还可以接受很多其它的信号对自噬进行调节,越来越多的证据表明,beclin-1可能是自噬的“守门人”。

自噬体的发生:
目前认为,自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网,而是在胞浆中重新生成的,但具体的机制尚不清楚。当beclin-1被活化后,胞浆中先形成很多个membrane source(自噬体膜发生中心),在它们不断扩展的过程中(phagophore到autolysosome),VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上(VMP1又叫TMEM49,已知唯一与自噬有关的跨膜蛋白),同时,MAP1-LC3由胞浆型(即LC3-I)转位到自噬体膜(即LC3-II),LC3这一转变过程可被Western Blot和荧光显微镜检测到,现已成为监测自噬体形成的推荐方法。

自噬与细胞死亡的关系:
有必要说明一下的是,细胞死亡是一个非常复杂的过程,为了研究方便,需进行分类,但我们思考时不要局限于这些人为的分类,而应注重于现象本身来研究其背后的机制。

一直以来人们从不同角度、用不同方法来观察细胞的死亡,并把细胞的死亡方式分为2类:坏死和凋亡,因为两者有着明显的区别,其中最主要的区别之一就是细胞膜的通透性——坏死细胞的细胞膜丧失了完整性,内容物被释放出来,染料可自由进入细胞,而凋亡细胞保持完整,无内容物释放,染料也被排斥。很多实验亦根据这一原理来设计以区分坏死和凋亡,这将在后面一一介绍,如同刚刚说明的那样,这些实验只能说明细胞膜的通透性(必要条件,不是充分必要条件),而不能用来证实坏死细胞或凋亡细胞。

一般认为坏死是被动的,不可控的,而凋亡是主动的,可控的。为了强调这一点,凋亡被定义为程序性细胞死亡(program cell death,PCD)。但无论是坏死还是凋亡,都是一个过程,是需要时间的(尤其是凋亡,从启动到完成,细胞要执行很多反应),而且细胞死亡后都有“尸体”。

在研究自噬与凋亡的关系时,人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体,但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点,如核固缩(pyknosis), 核破裂(karyorhexis)、细胞皱缩(shrinkage)、没有凋亡小体的形成等,被称为自噬样细胞死亡(autophagic cell death,ACD),它是一种新的细胞程序性死亡,为了与凋亡区别,被命名为Type II cell death,相应的,凋亡为Type I cell death,坏死为Type III cell death。

尽管这样,但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。到底是Cell death by autophagy(自噬引起死亡)还是Cell death with autophagy(死亡时有自噬发生,但不是直接原因)?对此,自噬研究领域“大牛”级专家Levine Beth在一篇nature的Review中表达了自己的观点。由于在形态学上2者无明显区别,但通过阻断自噬,观察细胞的结局可区分开来:Cell death by autophagy细胞存活,而Cell death with autophagy细胞死亡。

自噬与肿瘤的关系:
与凋亡(在肿瘤细胞中一般都存在缺限)不同,自噬是被优先保留的。无论是肿瘤细胞还是正常细胞,保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。因为细胞中随时产生的“垃圾”(破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等)都需要及时清除,而这主要靠自噬来完成,因此,自噬具有维持细胞自稳的功能;如果将自噬相关基因突变失活,如神经元会发生大量聚集蛋白,并出现神经元退化。同时,自噬的产物,如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物,可以说,自噬就是一个“备用仓库”。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。更重要的是,自噬活性可在代谢应激(饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等)时大大增强,表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体,这一现象被称为“自噬潮”(autophagic flux),广泛用于自噬形成的监测。自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持,有利于细胞的存活。

鉴于自噬的上述作用,自噬可为肿瘤细胞带来几大好处:
(1)肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点,对营养和能量的需求比正常细胞更高,但肿瘤微环境往往不能如意,如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断,而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。

(2)当化疗、放疗后,肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分,而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质,并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。

由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会,而对于肿瘤细胞群体而言,需要一部分细胞发生坏死,以引发适度的炎症(有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等)。研究发现,很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬(由于凋亡通路已受阻,抑制自噬会促进坏死),但具体机制尚不清楚。

自噬的研究方法:
正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察,因此,必须对自噬进行人工干预和调节,经报道的工具药有:

(一)自噬诱导剂
1.  Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模拟内质网应激
2.  Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化锂):IMPase 抑制剂(即Inositol monophosphatase,肌醇单磷酸酶)
3.  Earle's平衡盐溶液:制造饥饿
4.  N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制剂
5.  Rapamycin:mTOR抑制剂
6.  Xestospongin B/C:IP3R阻滞剂

(二)自噬抑制剂
1.  3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制剂
2.  Bafilomycin A1:质子泵抑制剂
3.  Hydroxychloroquine(羟氯喹):Lysosomal lumen alkalizer(溶酶体腔碱化剂)

除了选用上述工具药外,一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预:包括反义RNA干扰技术(Knockdown)、突变株筛选、外源基因导入等。
编辑: 呜咽
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