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原位杂交实验要求及步骤

发布时间:2012-02-19 00:00:00 阅读量:48549次



 

原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry,ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization),属于固相分子杂交的范畴,它是用标记的DNA或RNA为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同,原位杂交可分为DNA-DNA杂交,DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。

根据探针的标记物是否直接被检测,原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交,杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针,最后通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。

原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记(如35S,3H,32P等)仍然广泛使用,但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针),更引起科技工作者的极大兴趣。
 
一、基本要求
1.  组织取材:组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快,所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。
2.  固定目的是:
(1)保持细胞结构;
(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平;
(3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛,与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同,多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
3.  增强组织的通透性和核酸探针的穿透性:
(1)稀酸处理和酸酐处理:为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合,以降低背景,杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min,经乙酸酐处理后,组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min,稀酸能使碱性蛋白变性,结合蛋白酶消化,容易将碱性蛋白移除。
(2)去污剂处理:去污剂处理的目的是增加组织的通透性,利于杂交探针进入组织细胞,最常应用的去污剂是Triton X-100。注意:过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构,而且还会引起靶核酸的丢失。
(3) 蛋白酶处理:蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露,以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K),还有链霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)等。
4.  杂交缓冲液孵育:
杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2 hr,以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点,达到减低背景的目的。
5.  防止污染:
由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶,为防止其污染影响实验结果,在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套,实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤(180℃)以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。
6.  双链DNA探针和靶DNA的变性:
杂交反应进行时,探针和靶核酸都必须是单链的。如果用双链DNA探针进行杂交(包括检测RNA时),双链DNA探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应,不然解链的探针又会重新复性。
编辑: 赵栋2012
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